细胞复苏的成败与冻存及复苏操作息息相关。上周我们已经探讨了一些细胞冻存时常见的错误细节，具体内容可以参考《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本文将从复苏的角度出发，分析复苏过程中可能出现的问题。

复苏步骤回顾

复苏的基本步骤如下：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，并让培养基复温，同时调整离心机至适当的转速。
2. 准备一个15ml离心管，并加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，迅速浸入水浴锅中摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入已加培养基的离心管中，并以1000rpm进行3分钟的离心。
5. 弃去上清液，重悬细胞并接种到培养器皿中，最后将其放入培养箱中。

复苏过程中的常见错误

以下是一些在细胞复苏中常见的错误操作：

1. 如果液氮罐或冰箱离水浴锅过远，且没有采取防冷措施，可能导致细胞在运输过程中开始融化（特别是在夏季）。因此，冻存细胞应放置在干冰或冰盒中运输至水浴锅。
2. 在运输冻存管时，避免手直接接触到细胞部分或将管放在口袋中。请勿用手触摸冻存管身，以免地方温度升高导致细胞开始融化。应捏住管盖或将其放在容器中运输。
3. 不要使用手捂热的方法来融化细胞（搓热也不可行）。手心的温度不足以使细胞均匀受热，且降温速度过慢，可能导致细胞死亡。
4. 在水浴过程中，如果没有严格控制时间，而是将冻存管放置在水中静置，可能会影响细胞的复苏效果。复苏需遵循“快融”的原则，建议在2分钟内充分融化细胞，水浴时间越长，活率越低。最佳方法是捏住管盖，快速摇晃管身，促进细胞融化。切忌将冻存管静置在水浴中。
5. 水浴后如管内仍有未融化的大冰块，可能导致细胞死亡。一方面，冰块中的细胞缓慢升温而死；另一方面，冰块会使已融化的细胞遭受低温损伤。若2分钟内很难融化，可以尝试将水浴锅温度提升至39度（经过小编验证），并加快摇晃速度。担心污染的同学还可以将冻存管放入一次性PE手套内再进行水浴。需要注意的是，水浴锅里的水不能过少，否则冻存管放入后局部温度将不足，导致融化过程过慢。
6. 细胞融化后未及时离心去除DMSO。一些同学可能会在细胞融化后直接加10倍培养基稀释，而不进行离心，等细胞贴壁后再换液。虽然这对于易贴壁的细胞可行，但不适合悬浮细胞。DMSO对细胞有一定毒性，某些细胞如HL-60细胞对DMSO特别敏感。如果不确定自己的细胞对DMSO的敏感性，建议仍然选择离心去除上清液，以确保细胞安全。

以上总结是基于小尚多年的经验，并结合《冻存篇》的内容，基本涵盖了影响复苏成功的主要因素。如果还有其他未提及的知识点，欢迎同学们在评论区补充交流。同时，选用优质的细胞冻存与复苏产品也能有效提升复苏成功率，在此推荐AG百家乐的专业解决方案，让您的实验更加顺利。